Молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Поглощение и флуоресценция обуславливаются строением энергетических уровней электронов молекулы и поэтому является специфическим для каждого типа молекулы свойством (см. подробнее в статье спектроскопия, электронно-колебательная).

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией. Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Флуоресцентный микроскоп состоит из источника света, возбуждающего флуорофор; детектора, регистрирующего излучение флуорофора; оптической системы, которая обеспечивает фокусировку света и увеличение объекта. Согласно классическим работам Э. Аббе, разрешение оптической системы, построенной на использовании линз, ограничено свойством дифракции света. Предельное расстояние, на котором могут быть различены два объекта (d), определяется длиной волны света , угловой апертурой объектива  и показателем преломления среды n:

Поскольку обычно n < 1,56,  < 70^o, а длина волны используемого излучения находится в диапазоне 350–600 нм, то лучшее разрешение традиционных микроскопов составляет более 200 нм в фокусной плоскости и более 450 нм вдоль оптической оси.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов — двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения (флуоресцентная наноскопия).