Испускание фотона молекулой (флуоресценция) происходит из высокоэнергетических состояний. Переход в эти состояния происходит при поглощении молекулой фотона, энергия которого соответствует энергетической разнице между основным и возбужденным состояниями молекулы. Однако такой переход возможен и при одновременном поглощении нескольких низкоэнергетических фотонов. Поскольку вероятность этого события пропорциональна квадрату интенсивности света, сфокусированного на образец, одновременное поглощение, а соответственно и испускание (двухфотонная флуоресценция) наблюдается только в фокусной плоскости микроскопической системы.

Высокая локализация возбуждения и применение менее энергичных фотонов, по сравнению с классическими флуоресцентными методами (см. флуоресцентная микроскопия) позволяет проводить исследования образцов на большой фокусной глубине (до 1 мм) с высоким контрастом и предохраняет их от выцветания и разрушения под действием света. Аналогичным по возможностям флуоресцентным методом является конфокальная микроскопия.